1.概述
核酸是由許多核酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在所有動(dòng)物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸， 化學(xué)組成、核 酸排列順序 不同。根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為核糖核酸，簡(jiǎn)稱 RNA 和脫氧核糖核酸，簡(jiǎn)稱DNA。
DNA是儲(chǔ)存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)基礎(chǔ)， RNA 在蛋白質(zhì)合成過程中起著重要作用，其中轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸，簡(jiǎn)稱 tRNA, 起著攜帶和轉(zhuǎn)移活化氨基酸的作用：mRNA是合成蛋白質(zhì)的模板；核糖體的核糖核酸，簡(jiǎn)稱rRNA, 是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的主要場(chǎng)所。
2.核酸提取樣品
普通樣品：血液、動(dòng)植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞、病毒、 髓、體液等等。
疑難樣品：唾液、痰液、土壤、糞便、頭發(fā)、石蠟包埋組織、骨骼、 牙齒、指甲、煙頭等等
3.核酸提取的方法
核酸包括DNA 、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，核酸提取的主要步驟為：裂解細(xì)胞去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除 其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除 RNA，反之亦然。沉淀核酸純化核酸，去除鹽類，有機(jī)劑等雜質(zhì)。
3.1堿裂解法
堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的。
3.2煮沸法
煮沸時(shí)將樣品中的DNA通過核酸裂解液的作用釋放出來，離心沉淀后將雜質(zhì)去除，上清液即可用作PCR擴(kuò)增。
3.3濃鹽法
利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M氯化納提取，得到的DNP粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩，使乳化，再離心除去蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中，用2倍體積95% 乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來。
3.4苯酚抽提法
苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制了DNase的降解作用，用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用 乙醇沉淀DNA。此時(shí)DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃慢慢繞成一團(tuán)，取出。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。
3.5水抽提法
利用核酸溶解于水的性質(zhì)，將組織細(xì)胞破碎后，用低鹽溶液除去RNA, 然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，離心后收集上清液，在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2. 6M. 加入2倍體積95%醇，立即用攪拌法攪出，然后分別用66% , 80%和95%乙醇以及丙銅洗滌，最后在空氣中干燥，即得DNA樣品，此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高，故一般不用，為除蛋白可將此法加以改良，在提取過程中加入SDS。
3.6陰離子去污劑法
用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA。由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合，因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵，所以常用陰離子去污劑提取DNA。
3.7硅膠膜法
可用于手工提取，也可用于自動(dòng)化提取。
硅膠模法核酸提取
3.8磁珠法
一般用于自動(dòng)化提取，生物磁珠是一種新型的功能化固體載體，其表面包被有活性基團(tuán)，可以與多種生物活性物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)，兼具有液體的流動(dòng)性和固體磁性材料等特點(diǎn)，在外磁場(chǎng)的作用下可以定向移動(dòng)和栠中，當(dāng)撤去外磁場(chǎng)后，稍加振蕩或抽吸又可均勻分散于液體中，從而使固液相的分離變的十分快捷方便，通過簡(jiǎn)單的洗脫可以得到純度很高的靶向物質(zhì)。
磁珠法核酸提取
4.提取純化方法比較
5.提取核酸的目的
提取完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子是下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。所以高質(zhì)量的核酸提取是至關(guān)重要的，他可以做很多很多的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，下面就簡(jiǎn)要闡述常見的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
5.1PCR
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction), 簡(jiǎn)稱PCR是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用放大擴(kuò)增特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是 60°C 左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度 (72°C 左右），DNA 聚合酶沿著磷酸到五碳糖 (5'-3') 的方向合成互補(bǔ)鏈。基于聚合酶制造的 PCR 儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度、復(fù)性溫度、延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。
5.2轉(zhuǎn)基因
轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Genetically Modified , 簡(jiǎn)稱GM), 將基因片段轉(zhuǎn)入特定生物中，并最終獲取具有特定遺傳性狀個(gè)體的技術(shù)。不管轉(zhuǎn)入的基因來自進(jìn)化樹上再遠(yuǎn)的物種，接受這基因的也能讀解，那是因?yàn)镈NA是通用代碼，細(xì)胞知道如何解讀。即使親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的物種---比如人類和細(xì)菌---也共享許多基因 ，在數(shù)十億年的進(jìn)化過程中一直保持不變。基因從哪來，并不是關(guān)鍵，起到的作用才是它們的功能，所以植物轉(zhuǎn)入動(dòng)物基因不會(huì)有動(dòng)物的味道。
轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)來源于進(jìn)化論衍生來的分子生物學(xué)。基因片段的來源可以是提取特定生物體基因組中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被轉(zhuǎn)入特定生物中，與其本身的基因組進(jìn)行重組，再?gòu)闹亟M體中進(jìn)行數(shù)代的人工選育，從而獲得具有特定的遺傳性狀個(gè)體。該技術(shù)可以使重組生物增加人們所期望的新性狀，培育出新品種。
5.3構(gòu)建基因文庫(kù)
一個(gè)生物體的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶部分酶切后，將酶切片段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個(gè)生物體的整個(gè)基因組，也就是構(gòu)成了這個(gè)生物體的基因文庫(kù)。將這些載體導(dǎo)入到受體細(xì)菌或細(xì)胞中，這樣每個(gè)細(xì)胞就包含了一個(gè)基因組DNA片段與載體重組DNA分子，經(jīng)過繁殖擴(kuò)增，許多細(xì)胞一起包含了該生物全部基因組序列，我們將這一個(gè)集合體叫做基因文庫(kù)。
用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總DNA或染色體DNA的所有片斷隨機(jī)地連接到基因載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的無性繁殖系（克隆），在制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫(kù)。同一定義也適用于某種生物的線粒體DNA或葉綠體DNA的基因文庫(kù)。由于制備DNA片段的切點(diǎn)是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的DNA片段既可能是一個(gè)或幾個(gè)基因，也可能是一個(gè)基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近DNA順序。
5.4分子測(cè)序
利用DNA聚合酶合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈，在三圍空間中記錄模板位置和核苷酸序列信息，再反向構(gòu)建模板的序列。除了DNA合成反應(yīng)的三大要素（模板、酶、核苷酸）之外，模板所處位置和反應(yīng)循環(huán)中單色熒光標(biāo)記的核苷酸順序（如何A、C、G、T）也是最終DNA序列能夠完成的關(guān)鍵要素。如果反應(yīng)所用的核苷酸標(biāo)記著四種不同的熒光，則每一次反應(yīng)循環(huán)就需要切換不同波長(zhǎng)的光以記錄不同的堿基。
5.5分子診斷
分子診斷：應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的變化而做出診斷的技術(shù)，稱為分子診斷。分子診斷是預(yù)測(cè)診斷的主要方法，既可以進(jìn)行個(gè)體遺傳病的診斷，也可以進(jìn)行產(chǎn)前診斷。分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)。
分子診斷主要是指編碼與疾病相關(guān)的各種結(jié)構(gòu)蛋白、酶、抗原抗體、免疫活性分子基因的檢測(cè)。
5.6親子鑒定
親子鑒定就是利用法醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和遺傳學(xué)的理論和技術(shù)，從子代和親代的形態(tài)構(gòu)造或生理機(jī)能方面的相似特點(diǎn)，分析遺傳特征，判斷父母與子女之間是否是親生關(guān)系 是法醫(yī)物證鑒定的主要組成部分，親子鑒定在中國(guó)古代就已有之，如滴骨驗(yàn)親、滴血驗(yàn)親等。
DNA親子鑒定實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：
第一步：DNA提取
把樣本細(xì)胞核中所含有DNA提取出來，然后進(jìn)行一定的純化，化除樣本中的雜質(zhì)。
第二步：PCR擴(kuò)增
PCR的中文名為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，簡(jiǎn)單的說，華科基因 PCR 擴(kuò)增這一步就是把我們所需要的片段通過酶促反應(yīng)，在PCR 儀上進(jìn)行大量復(fù)制，放大到通過某些專用儀器可以看到的程度。
第三步：后PCR反應(yīng)
這一步主要是上ABI測(cè)序儀檢測(cè)的準(zhǔn)備階段，將雙鏈的DNA打開，加一些檢測(cè)用的的內(nèi)標(biāo)，主要是來標(biāo)記檢測(cè)的片段長(zhǎng)度。
第四步：毛細(xì)管測(cè)序儀檢測(cè)
由于DNA帶有電荷，通過毛細(xì)管電泳的方法，不同片段DNA長(zhǎng)度的電泳速度不同，在同樣的電壓，同樣的電泳時(shí)間下，泳動(dòng)的距離不同，這些長(zhǎng)短不同距離可以通過前期加入的內(nèi)標(biāo)測(cè)量分辨出來，同時(shí)可通過一定的軟件顯示在電腦上，方便檢測(cè)員處理和分析數(shù)據(jù)。
第五步：分析數(shù)據(jù)，出具報(bào)告
主要是檢測(cè)人員將所得結(jié)果進(jìn)行分析匯總、計(jì)算，然后出鑒定結(jié)論和報(bào)告。
5.7法醫(yī)鑒定
法醫(yī)鑒定是司法程序中有關(guān)技術(shù)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容。是運(yùn)用醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、人類學(xué)及物理、化學(xué)等方面的知識(shí)對(duì)與人身有關(guān)的活體、尸體及生物物證等的檢驗(yàn)鑒定工作，從而取得死亡原因、傷害程度、兇器種類、血型分析、事實(shí)確認(rèn)等結(jié)論性意見。法醫(yī)鑒定結(jié)論是三大訴訟法的重要證據(jù)種類，由于其與人身密切相關(guān)，決定了法醫(yī)鑒定在訴訟和 非訴訟活動(dòng)中具有十分重要的意義。它是查明案件事實(shí)，分清案件性質(zhì)的重要根據(jù)，同時(shí)又是鑒別案內(nèi)其他證據(jù)是否真實(shí)的重要手段。可以說，法醫(yī)鑒定工作的好壞在一定程度上影響著司法公正與否。
5.8基因敲除
基因敲除(knockout) 是指一種遺傳工程技術(shù)，針對(duì)某個(gè)序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏障，并可進(jìn)一步對(duì)生物體造成影響，進(jìn)而推測(cè)出該基因的生物學(xué)功能。
基因敲除和基因嵌入技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)90年代出現(xiàn)的最新外源DNA導(dǎo)入技術(shù)。基因敲除是基因打靶技術(shù)的一種，類似于基因的同源重組。指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中。此法可產(chǎn)生精確的基因突變，也可正確糾正機(jī)體的基因突變。基因嵌入又稱基因置換，它是利用內(nèi)源基因序列兩側(cè)或外面的斷裂點(diǎn)，用 同源序列的目的基因整個(gè)置換內(nèi)源基因。目前用基因敲除和基因嵌入的技術(shù)有Cre/Lox P系統(tǒng)、 FLPI 系統(tǒng)等。
5.9基因芯片
基因芯片(genechip (又稱DNA芯片、生物芯片）的原型是80年代中期提出的。基因芯片的測(cè)序原理是雜交測(cè)序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG, 與基因芯片上對(duì)應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通過確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。
5.10動(dòng)植物資源保存鑒定
建立瀕危野生動(dòng)植物種質(zhì)基因資源庫(kù)和實(shí)施瀕危動(dòng)植物的基因保護(hù)工程，對(duì)我國(guó)瀕危野生動(dòng)植物的保護(hù)和繁衍，保持我們所生活的環(huán)境生物的多樣性和生態(tài)鏈的平衡，無疑具有重大意義。但是，對(duì)于已經(jīng)進(jìn)入生物經(jīng)濟(jì)時(shí)代的人類來說，其意義已遠(yuǎn)不止這么簡(jiǎn)單。
提取出高質(zhì)量的核酸在其他領(lǐng)域和方向都有不可低估的作用。但是僅僅依靠傳統(tǒng)的核酸提取方法，很難滿足日益巨大的中國(guó)核酸市場(chǎng)，因此全自動(dòng)核酸自動(dòng)提取儀的出現(xiàn)將會(huì)給中國(guó)的核酸提取市場(chǎng)帶來光明。
山東博科-核酸提取儀
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